【前言 】

干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病治疗的过程。干细胞治疗被认为是未来医疗的支柱。干细胞产品真正走向产业化、商业化环节，所面临的巨大挑战，其中关键的瓶颈问题是干细胞的高质量和规模化生产。

2023年9月，我国首个人源干细胞国家标准《生物样本库多能干细胞管理技术规范》（GB/T42466-2023）发布，在质量控制这一节，提到干细胞的验收标准可参考T/CSCB-0002与T/CSCB-0005的内容，其中影响质量的重要因素有细胞来源，细胞活率，细胞生长活性等。干细胞产品的质量特性一般在细胞培养阶段形成。因此，细胞制备工艺对细胞质量、活性等具有重要影响。工艺开发过程中应严格选择合适的培养体系（细胞来源、培养基和添加因子）、培养方式，准确控制培养时间和培养代次等。

【Part 1——培养体系】

细胞的来源是影响其质量的首要因素之一。不同的细胞来源可能会影响其遗传特性、稳定性以及功能表达。因此，在选择干细胞时，必须考虑其来源的质量和适用性，以确保所选细胞具有良好的治疗潜力。

图1. 不同年龄组细胞生长活力对比

Stem Cells Int. 2019 Aug 1;2019:5197983

干细胞的生物学效力和增殖特性，会随着传代次数的增加逐渐下降。研究指出，细胞传代不宜低于3代。从各代干细胞生长曲线检测结果表明，P4-P7代的数据都在高活性范围之内。就间充质干细胞（MSCs）而言，临床应用的最佳代次应在4-8代，因此细胞代次的选择对于制备工艺也是重要影响因素之一。

图2：不同代次hUCMSCs的增殖活性检测以及表面标记表达

Chinese Journal of Tissue Engineering Research,

2017, 21(13): 2015-2022 

对于细胞的培养，培养基类型的选择，也是干细胞生产过程中需要考虑的关键问题。用于干细胞培养应采用成分明确、无动物源成分的GMP级培养基。若生产过程中使用非人类来源的成分，如胎牛血清（FBS）。这些动物源成分对人体有潜在危害，可能引起不必要的免疫反应，导致朊病毒和传染病的传播。

图3：3D FloTrix® 间充质干细胞无血清培养基

（点击图片，了解详情）

【Part 2——培养方式】

细胞培养作为生物医学研究和药物开发的重要工具，已经广泛应用于科学研究、药物筛选、组织工程等领域。目前干细胞培养方式有二维培养和三维培养两种。

图4：二维和三维细胞培养模式图

Chinese Journal of Cell Biology 2015, 37(8): 1140-115

二维培养

二维（2D）平面培养是传统的细胞培养方法，细胞贴附在普通的玻璃或塑料材质的培养瓶表面，沿着二维平面延伸生长，通常呈现出扁平的单层状态。细胞-细胞相互作用受限，仅限于水平方向。

三维培养

三维（3D）细胞培养是近年来发展起来的一种模拟体内三维生长环境的细胞培养方式。将细胞与三维结构的支架材料（例如微载体）共同培养，构成三维的细胞&载体复合物，使其在三维立体空间生长、增殖和迁移。3D培养更真实地再现了细胞与细胞之间以及细胞与胞外基质之间地相互作用，更准确地模拟细胞在组织中的实际微环境。且三维培养方式更易于规模化生产，可实现产业化。

目前干细胞规模化生产中，集中于搅拌槽生物反应器、中空纤维生物反应器等培养工艺。

中空纤维生物反应器

中空纤维生物反应器一次运行可生产大量干细胞。但在贴壁细胞培养过程中，无法检测细胞增殖状态和质量情况，且收获过程面临胰酶消化时间长、细胞收获效率及质量难以保障的问题。

搅拌槽生物反应器 + 微载体

基于微载体的搅拌槽生物反应器，在生物制药行业具有较为完善的经验和放大标准。干细胞附着在悬浮于搅拌容器中的微载体上。作为干细胞附着培养介质，选择合适的微载体是干细胞培养扩增过程中保证细胞数量和质量的关键变量。

图5. 尊龙凯时 - 人生就是搏!生物全线可降解微载体

微载体不仅要满足不同类型干细胞的粘附和增殖要求，还要考虑如何去除微载体。尊龙凯时 - 人生就是搏!生物开发的3D FloTrix® 全封闭自动化生产工艺中采用的自主研发的3D TableTrix® 及3D RecomTrix® 微载体，通过特异性降解技术，可温和收获细胞。

且微载体原材料选用药用辅料级别并完成了第三方质量检测及安全性评价，同时已获得2项CDE药用辅料资质（F20200000496；F20210000003），3项FDA原料药及药用辅料资质（DMF：037798、035481；MF：29721），在保证安全性情况下进行细胞收获，且收获的细胞满足干细胞的基本生物学质量要求。

【Part 3——培养工艺】

传统人工培养既费时又费力，已逐渐被淘汰。干细胞治疗产品制备过程中，建议采用全封闭的或半封闭的自动化制备工艺，尽可能使用专用的、产品特定的或一次性使用的装置，以减少污染和交叉污染的风险。培养过程建议采用连续的制备工艺，如果生产过程中有不连续生产的情况时，应对细胞的保存条件和时长进行研究与验证。建立规范的全封闭自动化工艺操作步骤、工艺控制参数、内控指标等，对生产的全过程进行监控，以确保干细胞质量和安全性。整个培养工艺减少人工操作，尽可能实现全封闭自动化，减少污染或交叉污染的风险。

图6. 尊龙凯时 - 人生就是搏!生物【百亿细胞】智造工艺

细胞的活率和生长活性是评估干细胞质量的重要指标。当干细胞回输到体内，只有活着的干细胞能真正起到修复或治疗的作用，失活细胞不仅有碍有效性，还可能会引发机体毒性反应。所以细胞活率不但关乎细胞质量，更涉及人体自身的安全。因此，国内监管对于干细胞产品的活率要求较高，通常要求新鲜细胞制剂的活率不低于90%，而冻存细胞制剂的活率则不低于70%。因此，在全封闭、自动化、规模化生产工艺上要严格控制其培养条件（温度、溶氧、pH和CO2等）、培养时间、收获方式等环节，尽量减少对细胞活率的影响。另外，在生产关键节点，对样品的有关检项，如无菌、内毒素、支原体、内外源病毒等均应符合要求。

【总结】

干细胞产品类型多样，不同干细胞类型，其制备工艺的内容和流程也有所不同，应尽量遵循药品生产工艺的一般规律，应用质量源于设计的理念，关注制备工艺与产品质量的关系。稳定的规模化干细胞制备工艺可以保证干细胞治疗产品的质量稳定性，有助于确保临床试验结果的一致性。

【尊龙凯时 - 人生就是搏!生物】