【前沿】

近日，由复旦大学附属中山医院颜志平教授团队在《Biomaterials》【IF：12.8】发表了题为“Hypoxia-actived cascade nanovaccine for synergistic chemoembolization-immune therapy of hepatocellular carcinoma（缺氧激活的级联纳米疫苗用于肝细胞癌的协同化学栓塞-免疫治疗）”的文章。

研究发现，使用获得中美两国药监局批准的药用辅料及原料药的3D TableTrix® 微载体作为化学栓塞剂，已被证实可以减缓原位肿瘤的体积增长，并一定程度延长肝细胞癌（HCC）模型动物的生存时间。

在此基础上，将纳米疫苗整合到3D微载体中（即，TRZM），可以显著增强对HCC的治疗效果：微载体表现出良好的载药性和外周动脉闭塞特性，而纳米疫苗则能够激发免疫细胞渗入肿瘤组织内并激活免疫反应，促进肿瘤细胞的凋亡，从而在物理阻断的基础上增加了一种生物治疗机制。

尽管栓塞治疗可能会在短期内引起肝功能的一些波动，但研究表明，通过血管内途径给药的3D微载体或纳米疫苗对肾功能和其他关键器官的功能没有显著的（负面）影响。这表明该联合疗法在提高疗效的同时，也保持了较好的安全性和耐受性，为HCC患者提供了一种新的治疗选择。

图1. 研究设计示意图：TRZM的合成路径，以及其作为功能性栓塞剂治疗兔VX2肝癌模型

原文链接：

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961224000140#undfig1

【Part 1 研究背景】

肝细胞癌（HCC）是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率一直居高不下。目前治疗HCC的主要方法涵盖外科手术（如肿瘤切除和肝脏移植）、局部治疗和系统治疗。其中外科手术在早期HCC患者中效果显著，但由于肝癌具有隐蔽性且扩散速度快，许多患者都未能及时接受手术治疗。在系统治疗领域，免疫检查点抑制剂（ICIs）已在晚期HCC的治疗中显示出潜力，并且基于纳米技术的新型药物递送系统正在被广泛研究，以提高免疫治疗的疗效。此外，经导管动脉化疗栓塞术（TACE）作为一种局部治疗方法，通过微创手段将高浓度药物直接输送至肿瘤部位，有效降低了药物的全身性副作用，并利用栓塞材料切断肿瘤的血液供应，达到“饿死”癌细胞的目的。

通过结合系统治疗和局部治疗的优势，可以开发一种新型的“鸡尾酒”疗法——将纳米疫苗整合到化学栓塞剂中。这种创新疗法不仅能够提升HCC的治疗效果，还可能在未来的临床实践中得到更广泛的应用。通过这种方式，可以更有效地激活患者自身的免疫系统，同时利用化学栓塞剂的物理作用，共同对抗HCC，为患者带来新的治疗希望。

【Part 2 研究内容】

2.1 纳米疫苗的制备与抗肿瘤疗效验证

该研究首先对纳米疫苗进行了制备。

据报道，替拉扎明（Tirapazamine, TPZ）是一种缺氧激活的前药，可以通过细胞内还原酶代谢产生高反应性自由基，能够在缺氧环境中诱导DNA链断裂和拓扑异构酶II毒性。研究表明TPZ可以通过诱导细胞周期停滞和下调缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达来改善肿瘤微环境。

雷西莫特（Resiquimod, R848）是一种TLR 7/8双激动剂，此前已报道R848在促进抗肿瘤免疫方面具有高效力，并且在其促进树突状细胞（DCs）成熟和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）从M2向M1极化方面有更大的参与。

由有机配体及其配位的金属离子/离子簇组成的金属有机框架（MOFs）已被越来越多地应用于纳米载药。其中，得益于高孔隙率、易于制备、可调节的孔径和高效的药物封装等特性，沸石咪唑酯骨架材料-8（Zeolitic imidazolate framework – 8, ZIF-8）作为癌症治疗的载体是特别有利的。

该研究将TPZ和R848分别封装在纳米颗粒ZIF-8的框架中（后文分别表示为TZ和RZ，混用时记为TRZ），开展了抗肿瘤验证。在体外试验中，给药24小时后的Huh-7细胞在常氧环境下细胞活率降低至68.0%，在缺氧环境下则能降低至29.1%，并经细胞凋亡试验验证，TRZ处理组在缺氧环境下诱发的细胞凋亡率高达75.3%。

为分析研究原位给药后的肿瘤微环境，该研究检测了给药7天后肿瘤组织中的免疫细胞，发现TRZ处理组的小鼠肿瘤组织中，总体免疫细胞（CD45+）增多至33.04%，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）较其他处理组显著增加，并且M1表型的TAMs显著增多。该研究还引入了一个双侧皮下的肿瘤模型，将小鼠背部左侧的肿瘤指定为“原发肿瘤”，用于原为注射给药，右侧的肿瘤则指定为“远端肿瘤”，不作处理，实验设计如下图A。经监测，原位注射TRZ可以有效减缓原发肿瘤（下图B）和远端肿瘤（下图C）的生长，即发挥远端作用，与此同时小鼠体重没有明显变化（下图D）。在该过程中，远端肿瘤组织内的肿瘤浸润性T淋巴细胞（TILs）显著增多（下图E-G），并且血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-6等细胞因子有显著提升（下图H-J），说明纳米疫苗引发了全身性的免疫激活。

以上结果表明，局部注射纳米疫苗TRZ可以有效激活肿瘤微环境，募集更多TILs侵入肿瘤组织内，在原位和远端肿瘤中发挥抗肿瘤效应。

2.2 功能性栓塞剂TRZM的制备与抗肿瘤疗效验证

随后，该研究引入了3D TableTrix® 微载体（M）作为栓塞剂和载药平台进行应用。将制备好的纳米疫苗与1 mg/mL3D微载体M在生理盐水中共同搅拌2小时，从而制备载药后的微载体（标记为TRZM）。从扫描电镜下可以观察到纳米疫苗吸附在微载体M的孔洞表面，结合EDS能谱分析则可以进一步观察到纳米颗粒ZIF-8中的锌元素（Zn）富集到了3D微载体M上，佐证了3D微载体M对于纳米疫苗的装载能力。

图3. 纳米疫苗可装载到3D微载体M

该研究在兔VX2肝癌模型中，通过TACE手段将空3D微载体M或装载纳米疫苗的微载体（RZM、TZM、TRZM）注射到肿瘤供血动脉中，通过数字减影血管造影（DSA）表征术后肿瘤区域的血管几乎全部停止血供（下图B）。通过超声成像监测术后15天内的肿瘤大小，发现血管内单独注射的纳米疫苗TRZ对原位肿瘤的抗肿瘤效果不如TACE的空载体M，而相比之下，联合疗法TRZM则能显著地抑制肿瘤生长，并且将模型兔的生存期延长至60天以上（下图C-E）。此外，TRZM还能显著抑制肿瘤向肺部和腹腔内的转移。以上结果表明，3D微载体M表现出良好的载药性和外周动脉闭塞特性，用TRZM治疗HCC模型对原位肿瘤和远端肿瘤都可以起到非常有效的系统性抗肿瘤疗效。

图4. TRZM在兔VX2肝癌模型中的抗肿瘤效应

为探究TRZM的抗肿瘤机制，该研究对肿瘤样本深入进行了病理分析。增强CT的结果与超声成像一致，TRZM组的原位肿瘤体积最小（下图A），Ki67免疫组化也显示TRZM组的肿瘤细胞增殖最低（下图C、F）；而H&E染色表明TRZM组的肿瘤细胞坏死最高（下图B、E），肿瘤区域内的活性氧（ROS）也呈相同趋势（下图D、G）；此外，TZM和TRZM还进一步降低了肿瘤区域的血管新生CD31表达。以上结果表明，以装载纳米疫苗的微载体作为栓塞剂的联合疗法可以提高原位肿瘤内的ROS水平，并抑制肿瘤内的血管新生，从而直接发挥对原位肿瘤的抗肿瘤疗效。

图5. TRZM在兔VX2肝癌模型中的抗肿瘤机制

2.3 载体安全性验证

该研究还分别从体外、体内对载体进行了安全性验证。

在体外研究中，该研究检测了纳米颗粒ZIF-8（Z）和3D TableTrix® 微载体（M）在不同剂量（0、1、5、10、25、50和100 μg/mL）下的溶血和细胞毒性。尽管纳米颗粒Z和微载体M的溶血率随浓度略有增加，但保持在低于5%的低水平（下图A）。此外，将纳米颗粒Z或微载体M按不同剂量在与HuH-7细胞共孵育24小时，对细胞活性几乎没有影响（下图B）。这些发现表明纳米颗粒Z和3D微载体M均具有良好的生物安全性。

图6. 纳米颗粒Z与3D微载体M的体外生物安全性验证

在体内研究中，通过H&E切片染色没有发现经血管内给药的3D微载体M对心、肝、脾、肺、肾等重要器官存在器官毒性或损伤（下图A）。所有TACE组的ALT、AST指标在术后3-7天内有提高，但在术后15天均回落至基线水平（下图B、C）；而肾功能指标Cr、BUN则没有明显变化（下图D、E）。TACE会导致一定程度的肝细胞损伤、并对肝功能造成暂时性的影响，这是业内公认的情况。以上结果进一步验证了3D微载体M和TRZM的生物安全性。

图7. 纳米颗粒Z与3D微载体M的体外生物安全性验证

【Part 3 研究结论】

该研究成功开发了一种新型的癌症纳米疫苗（TRZ）用于HCC模型的治疗，可以在缺氧条件下有效诱导肿瘤细胞凋亡；而将3D TableTrix® 微载体作为栓塞剂，在物理上阻断了肿瘤的血液供应，从而限制了肿瘤的生长。联合纳米疫苗与微载体M用于TACE治疗HCC模型，对原位肿瘤的生长和远端肿瘤的转移起到了高效的抑制作用。该研究为将介入治疗与免疫治疗相结合的“鸡尾酒”疗法提供了一个重要思路，这在HCC的临床治疗中具有巨大的潜力。

【Part 4 研究团队】

本文通讯作者为复旦大学附属中山医院介入治疗科的颜志平教授、刘凌晓主任医师、复旦大学生命科学学院曹勇斌博士。

颜志平教授（主任医师）：

• 复旦大学附属中山医院介入治疗科主任，国家放射与治疗临床研究中心副主任。

• 擅长肿瘤及外周血管疾病的介入治疗。在国内首先对门脉高压直接性门体分流进行了系统研究，上世纪在国内率先开展90Y玻璃微球治疗肝癌的实验及临床研究。国际首创“125I粒子条腔内植入术”治疗门脉、下腔静脉及胆道恶性梗阻。

•主持多项国家级及省部级科研课题。国内外期刊发表学术论文120余篇，获得多项专利。

• 曾获中华医学科技二等奖、国家科技进步二等奖、上海市科技进步一等奖、上海市科技进步三等奖、上海医学科技奖三等奖、上海市优秀发明银奖等。

【Part 5 研究技术支持】

①更仿生：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率>90%，粒径大小可控于50-500μm区间， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培养。

②资质全：该产品已获得2项CDE药用辅料资质，登记号为【F20200000496；F20210000003】，3项FDA原料药及药用辅料资质，登记号为【DMF：037798、035481；MF：29721】

③易收获：特异性降解技术裂解微载体，收获相较于传统方式更高效更温和。

④更安全：拥有权威机构出具的裂解残留检测、细胞毒性、热原反应、遗传毒性、体内免疫毒理学相关质量评价报告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主动全身过敏性、腹腔注射给药毒性等安全性评价报告。

⑤易放大：通过3D培养方式，结合尊龙凯时 - 人生就是搏!生物3D细胞智造平台全线产品可以实现全自动封闭式大规模细胞培养，实现百亿量级细胞收获。

【尊龙凯时 - 人生就是搏!生物】