细胞外囊泡（EVs），包括外泌体和胞吐体，是细胞来源的纳米/微米级单层或多层膜结构。EVs含有生物活性货物，如核酸、脂质、蛋白质和碳水化合物，在细胞间通信中起关键作用。EVs的生物活性货物使其成为各种疾病的有前途的治疗剂。此外，EVs的表面介导体内运输和特定位点递送，使EVs可以作为小分子和生物药物的药物递送系统。

理想的EVs治疗和/或药物递送系统应具备以下属性：i）在给药前和暴露于生物环境时保持结构/生物分子完整性，ii）靶向递送，包括器官、细胞和亚细胞水平的特定位点相互作用。对于合成纳米颗粒，特定位点递送通常随着循环时间的延长而改善。然而，细胞毒性药物的延长循环可能导致白细胞损伤，造成血液毒性。临床前研究表明，静脉注射的EVs在几分钟内从血液循环中被清除。EVs在血流中持续存在的必要性尚不清楚。可能EVs由于比临床批准的合成纳米颗粒更复杂的表面，能够显示出优越的免疫逃避和靶向特性。在这种情况下，EVs可能需要更短的循环时间即可高效与目标相互作用。

EVs具有与其来源细胞类似的生物活性特性，但与细胞疗法相比，具有几个优势，包括由于消除了恶性生长和血管阻塞的风险而提高了安全性。此外，EVs的处理和储存比细胞更容易。已经完成了几项EVs临床试验，更多的试验正在进行中，以治疗各种疾病。令人鼓舞的是，自体和异体EVs试验均未显示毒性。此外，临床上频繁进行的血浆输注会导致数万亿EVs的转移，通常不会导致不良事件，进一步表明异体EVs的生物相容性。动物研究还表明，人类EVs的给药不会引发（免疫）毒性。

虽然EVs治疗和药物递送平台在临床前和临床研究中显示出良好的安全性，但EVs的意外免疫原性（除了无免疫毒性）仍然大部分未被探索。该Perspective重点讨论不利的免疫相互作用。读者可以参考其他文献了解故意诱导EVs免疫原性的研究，如基于EVs的疫苗和免疫治疗。

与自体EVs相比，异种和异体EVs可能会显示出被先天和适应性免疫系统增强清除的现象，尤其是在重复给药后。在适应性免疫系统的情况下，EVs相关的供体抗原结合到主要组织相容性复合体（MHC）分子上，会触发免疫反应。值得注意的是，与来源细胞相比，MHC分子在EVs上富集。独立于适应性免疫系统，单核吞噬细胞系统可以识别异种和异体细胞为外来物质，例如，由于巨噬细胞上自我识别配体-受体对的多态性。先天免疫系统这种立即辨别自体和异种/异体产品的能力是否适用于EVs仍然未知。过去十年的研究还表明，吞噬细胞可以对外来生物分子产生免疫记忆，这被认为需要适应性免疫系统的初次刺激。

尽管自体EVs具有较少的免疫清除，但它们面临相当大的挑战，如高生产成本和劳动密集型操作。此外，由于个体之间以及健康/疾病状况中的EVs异质性，自体EVs的治疗和药物递送效果可能会有很大差异。筛选最佳异体供体并汇集供体EVs可以减少批次间的变异性。因此，异体EVs在降低制造成本、提高批次一致性和确保疗效一致性方面具有前景。本文从批判性角度评估了EVs的潜在免疫原性，并讨论了减轻EVs不良免疫识别的新兴策略，以用于下一代治疗和药物递送系统。

EVs的免疫原性可能受到多种因素的影响，包括EVs的来源（来源和生物发生）、大小、内源/外源内容物、生产和储存方法、剂量、输注速度以及生物分子冠。

一般来说，移植的细胞只有在与受体基因和表观基因完全一致时才能成功逃避免疫识别。然而，获得这种一致性常常是具有挑战性的。干细胞（如胚胎干细胞、间充质基质细胞（MSCs）和脂肪来源的干细胞）具有低免疫原性，能够释放在细胞间通信和抑制免疫反应中起关键作用的EVs。癌细胞也能逃避免疫监视，其衍生的EVs可以维持免疫逃避特性并促进免疫抑制环境的形成。理解这些相互作用对设计具有免疫逃避特性的治疗EVs具有重要意义。

EVs涵盖广泛尺寸，不同类型的EVs显示出不同的尺寸特性。外泌体（30-200 nm）、胞吐体（0.1-1 µm）和凋亡小体（1-5 µm）在大小上有所重叠，影响其与免疫细胞的相互作用。小型EVs在肿瘤和炎症组织中显示出更好的递送效果，而较大尺寸的EVs在特定器官中显示不同的积累模式。尺寸和清除率与靶细胞摄取率的平衡是开发有效EVs治疗和药物递送系统的关键。

特定的表面组分可以作为免疫系统的伪装，而其他组分则加速免疫识别。EV表面蛋白（如四跨膜蛋白、凝集素和整合素）通过配体-受体机制在免疫细胞相互作用中发挥关键作用。工程技术的兴起使得在EV膜表面偶联或表达多种“不要吃我”信号分子（如CD47、CD55、CD59和CD200）成为可能，以克服吞噬清除。目前研究最广泛的“不要吃我”受体是巨噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα），它特异性识别广泛表达的跨膜蛋白CD47。CD47与巨噬细胞上的SIRPα结合，抑制巨噬细胞介导的吞噬作用。CD47存在于各种EVs上，减少了单核吞噬细胞系统的清除。

此外，EVs的高效递送还需要逃避其他免疫细胞（包括自然杀伤细胞和T细胞）的识别。MHC-I分子在所有有核细胞表面广泛表达，在呈递内源性抗原中起关键作用。在EVs的生产过程中，MHC-I分子不可避免地被整合到囊泡膜中。基因编辑技术使得选择性靶向敲除beta2-微球蛋白（B2M）基因成为可能，从而有效降低MHC-I分子的表达，使得这种EVs的免疫原性显著低于含有完整MHC-I分子的EVs。

非经典的MHC-I分子（如MHC-E、MHC-F和MHC-G）可以抑制NK细胞的活性。在癌细胞的背景下，MHC-G的异常表达使得释放含有MHC-G的EVs，从而促进宿主内免疫耐受的建立。免疫检查点分子如程序性死亡配体1（PD-L1）可以抑制T淋巴细胞的功能。在MSCs来源的EVs表面增加PD-L1的表达对T细胞、巨噬细胞和树突状细胞表现出免疫抑制作用。

EV膜上的糖类和脂质也是重要的信号分子，影响EVs的免疫原性。EVs的外膜表面具有丰富的糖类，其糖缀合物谱在影响细胞摄取和生物分布中起关键作用。脂质在细胞间通信和免疫调节中也起到积极作用。例如，癌细胞来源的EVs中的脂质可以产生免疫调节效应，包括代谢重塑和免疫细胞信号通路的调节。

选择适当的工程方法对于实现EVs表面生物分子的最佳表达至关重要。常见的工程技术包括基因工程、化学工程和膜杂交。基因工程通过表达载体（如质粒或慢病毒）将重组DNA转染到宿主细胞中，从而实现所需蛋白的表达。化学工程技术可以分为非共价和共价修饰。EV膜杂交（融合）通过物理挤压、超声波和电穿孔等方法将EV细胞膜与人工膜结合。常见的EV标记方法包括荧光、发光和放射性标记，但这些方法可能影响EVs的功能和免疫原性。

除了EVs的表面组分，内源和外源的内部货物也能显示免疫调节效果。例如，脑胶质瘤中高表达的环状RNA circNEIL3被包裹在EVs中并被巨噬细胞吞噬，导致免疫抑制表型。多种EV工程方法可用于在EVs内部加载外源货物，但这些方法可能影响EV的特性和免疫原性。间接加载是将源细胞暴露于货物中，尽管加载效率有限。直接加载内部货物的方法包括超声波、挤压、孔形成剂和反复冻融循环，这些方法可以暂时在膜上创建开口。然而，研究表明，超声波和挤压可能降低EVs携带的酶的活性，可能导致内源生物分子的损伤或丧失。

此外，可以通过基因工程使源细胞表达蛋白或RNA，并将其加载到EVs内部。与物理和化学加载方法相比，基因工程对EVs的结构完整性影响较小。通过将所需生物分子与EV内部蛋白融合，可以提高加载效率。基因工程技术还被用于赋予EVs免疫调节特性。例如，通过基因工程获得的载有CC16蛋白的EVs在急性肺炎小鼠模型中通过调节巨噬细胞和中性粒细胞展示了抗炎效果。

生产和储存方法可能导致不同程度的EV损伤，从而影响其免疫原性。例如，源细胞的状态可能影响EVs的免疫原性。细胞应激会通过应激诱导途径释放含有特定免疫调节介质的EVs。分离方法（如超速离心和死端过滤）可能导致EVs聚集、膜损伤和生物分子损伤，可能引发免疫反应。细胞暴露的细胞内生物分子可触发免疫反应，但尚不清楚暴露的内部EV货物是否有类似效果。切向流过滤可作为一种温和的EV分离方法（控制剪切率），以减少EV损伤，从而减轻其免疫原性。

工程改造EVs以携带靶向、成像和治疗剂可能引起EV损伤，这些成分也可能引发免疫反应。EV样本中污染物的程度也可能影响免疫反应。例如，最近发现透明质酸（其对免疫系统的影响取决于分子量）是EV样本中的污染物，并且其水平因EV分离方法而异。超速离心和沉淀试剂盒会导致大量蛋白质污染物的共沉淀，而所有基于尺寸的EV分离方法都会保留蛋白质聚集物，这可能影响剂量准确性或错误归因于EVs的免疫调节效果。密度梯度超速离心可用于提高EV样本的纯度。

在临床实践中，即时使用新鲜制备的EVs通常不可行，因此储存成为临床转化EV治疗和药物递送系统的关键考虑因素。通常，EVs可以在4°C下短期储存（<48小时），而长期储存需要−80°C条件。然而，储存后EVs的效力通常会下降。反复冻融循环和长时间储存会导致EV融合或聚集，增加粒径并降低效力。缺乏冷冻保护剂会影响EVs的完整性，从而影响其免疫原性。

EVs的剂量和给药途径是影响其免疫原性的关键因素。不同的给药途径（如静脉注射、腹腔注射和皮下注射）会导致不同的生物分布和免疫细胞暴露模式。在小鼠模型中，静脉注射的EVs迅速积累在肝脏和脾脏，并在肺和肾中也有分布。腹腔注射的EVs在脂肪组织中的吸收优于静脉注射，而皮下和腹腔注射则增加了胃肠道和胰腺的EV吸收。

静脉输注的治疗和药物递送系统在临床转化中面临补体介导的输注反应的挑战。例如，抗聚乙二醇（PEG）抗体与PEG化纳米粒子的相互作用可能引发补体反应，导致过敏性休克。各种治疗方法可引起输注反应，通常在输注开始几分钟内出现。预先用药和降低输注速率可以缓解这种反应。虽然EVs可能也会出现输注速率反应，但由于该领域处于早期临床开发阶段，且主要依赖啮齿动物数据，目前缺乏证据。

合成纳米粒子和EVs在生物环境中被吸附的生物分子层包围，称为生物分子冠层。冠层的组成影响EVs的生物身份，包括免疫识别和清除。血液循环中的调理素（如补体蛋白、免疫球蛋白和凝血因子）在介导纳米粒子和EVs被先天免疫细胞摄取中起重要作用。补体蛋白H在肝细胞癌EVs中丰富，抑制其他补体蛋白的激活，促进肿瘤进展。减少EV模拟物的胆固醇含量可减少补体吸附。EVs的脂蛋白也影响其与免疫细胞的相互作用。核酸（DNA、RNA）是EV生物分子冠层的重要组成部分，影响免疫调节。修改EV表面可以改变冠层组成和免疫识别。去除供体液体中的生物分子冠层可能影响EVs的免疫原性。未来研究应确定有助于形成理想生物分子冠层的EV工程策略。

EV治疗和药物递送系统迅速发展的领域需要理解不期望的免疫原性，这对于开发安全高效的临床产品至关重要。这些努力需要免疫学、细胞生物学和纳米医学的跨学科合作。尽管几项关于EV的临床前和早期临床试验表明其显著缺乏免疫毒性，但免疫清除仍然很少被探索，特别是在大型动物模型中。可能导致EV免疫原性的因素包括来源、大小、表面组成、内部内容物、生产/储存方法、剂量、输注速率和生物分子冠层。理解这些因素对EV免疫原性的影响有潜力为未来开发最佳的EV治疗和药物递送系统提供信息。已经在探索各种调节EV免疫识别和清除的策略，包括添加和去除EV表面成分。未来的缓解策略可能依赖于改进的EV生产和储存方法结合工程化的免疫逃避表面。已经确定EV表面上的几种生物分子具有免疫刺激或免疫逃避特性。未来，组学技术（蛋白组学、糖组学、脂质组学、转录组学和代谢组学）结合功能研究，将对于全面识别和实施同时保留特定靶向能力的免疫逃避EV表面至关重要。