【前言】

近日，由中国肉类食品综合研究中心李石磊高级工程师和天津科技大学梁俊研究员共同在《食品科学》【EI收录】联合发表研究型文章：利用微载体系统规模化生产鸡成肌细胞。

原文链接：

http://www.spkx.net.cn/CN/10.7506/spkx1002-6630-20230330-310

【研究背景】

细胞培育肉是利用动物细胞体外培养的方式控制其快速增殖、定向分化并收集加工而成的一种新型肉类食品，该技术被认为是未来缓解环境污染、可持续发展、解决全球公共健康和动物福利等问题的潜在方案。细胞培育肉的生产需要借助细胞大规模体外培养实现，然而细胞贴壁培养所需相对较大的表面空间，从而限制了细胞培育肉工业化生产的规模。因此，为提升细胞大规模培养效率，研究人员将重点转向了可用于细胞3D培养的微载体开发以及生物反应器相关培养工艺的开发领域，通过不断提升微载体的比表面积利用率和生物相容性，提高细胞的综合培养效率，并不断降低细胞培养所需空间体积。

如今微载体得到了广泛研究，微载体的实用性主要反映在它们的机械性能、生物相容性、沉降系数、能否降解以及物理和化学刺激。在大规模细胞培养中，优化基于微载体的细胞培养条件对于其大规模应用非常重要。一种常用方法是利用微载体、生物反应器、细胞和培养基来构建细胞微生态系统，旋转烧瓶反应容器被广泛用于细胞培养，因为它可以提供均匀的培养环境，在培养过程中，细胞也受到各项外界因素的影响，例如培养条件、转瓶的转速和微载体的类型。目前为止，有关成肌细胞大规模培养用于细胞培育肉生产的研究鲜有报道。

本研究对C载体和3D TableTrix® 微载体进行对比，筛选出更为适合大规模培养成肌细胞的微载体。以3D TableTrix® 微载体为研究对象，优化了细胞三维培养的重要参数。通过珠对珠转移进行细胞更大规模的培养，并将带有细胞的微载体进行冻存和复苏，对比观察带有细胞的微载体和解冻细胞之间的增殖状况和形态差异，为大规模细胞培养提供理论基础和探索性实践，为细胞培育肉的工业化生产提供了前提条件。

【研究发现】

本研究发现使用3D TableTrix® 微载体在转瓶中对成肌细胞进行悬浮培养，在优化细胞培养的条件后，细胞培养效率得到显著提高。带有细胞的3D TableTrix® 微载体还可进行冻存并复苏继续使用，其在工业化大规模生产细胞培育肉领域具有良好的应用前景。

【研究设计】

图1：整体研究设计示意图

本研究的设计示意图如图1所示，细胞和3D TableTrix® 微载体混合加入到生物反应器中进行培养，通过优化细胞培养的工艺，提高细胞培养的效率和活力，最终使其应用于细胞培育肉工业化生产中。

【研究内容】

图2：3D TableTrix® 微载体-片剂(a)和C载体-粉末(b)目测及其微观图

图3：微载体的粒径分布

图4：细胞生长曲线(a)和差异性分析(b)

图5：3D TableTrix® 微载体溶解的明场图

从图2~5可以看出，3D TableTrix® 微载体是一种新型的多孔明胶微载体。这种微载体可以固定重量的片剂形式提供，片剂厚度为1.57±0.01mm，直径为8.01±0.05mm。而C载体是一种带正电、无孔的聚苯乙烯微载体，以粉末状的形式提供。C载体的平均粒径为265 μm要明显高于平均粒径为195μm的3D TableTrix® 微载体。同时细胞在3D TableTrix® 微载体的增殖效率显著高于C载体。

图6：不同搅拌方式对细胞转瓶培养体系的影响

图7：不同细胞接种数量对细胞培养结果的影响

图8：不同微载体质量浓度对细胞培养结果的影响

图9：不同转速下细胞数量的差异性分析(a)和生长曲线(b)

图10：不同补料方式下细胞的生长差异性分析（a）和生长曲线（b）

图11：不同血清含量对细胞培养结果的影响

图12：珠对珠转移对细胞转瓶培养的影响

图13：转瓶培养中细胞的葡萄糖代谢情况

图14：细胞在2L转瓶中的生长曲线

图15：微组织冻存对细胞的影响

图6~15中通过优化起始搅拌条件、细胞接种密度、微载体密度、搅拌速度、不同补料方式、血清、珠对珠转移等因素对细胞大规模培养的影响，并采用单因素变量法优化确定了细胞三维培养的重要参数。通过珠对珠转移进行细胞更大规模的培养，并将带有细胞的微载体进行冻存和复苏，观察对比带有细胞的微载体和解冻细胞的增殖状况和形态之间的差异。

【研究结论】

本研究中3D TableTrix® 微载体是一种可分散、可溶解的多孔微载体，使用操作简单，可通过珠对珠的转移消除细胞传代过程中的酶解离过程，极大简化了成肌细胞扩增的流程。

此外，细胞可以在3D TableTrix® 微载体上冷冻保存，解冻后仍具有高活力且保留了3D宏观结构，可作为种子细胞在后续批次的培养中进行珠对珠转移，也可用作植入性载体进行细胞培养。同时通过优化使用3D TableTrix® 微载体进行细胞培养的各项条件，提高了细胞培养效率，并可在大容量转瓶中进行连续培养。

【作者简介】

第一作者：刘屹森

研究方向为细胞培育肉的大规模培养。

通讯作者：李石磊

中国肉类食品综合研究中心高级工程师，主要研究方向为细胞培育肉研发与食品安全研究，主持或参与多项国家重点研发计划、中国工程院战略咨询项目、北京市科技计划项目、北京市博士后基金等项目/课题。

通讯作者：梁空俊

天津科技大学研究员，主要研究方向为生物基纳米自组装材料，主持或参与多项国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目/课题。

【研究技术支持】

更仿生：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率>90%，粒径大小可控于50-500μm区间， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生细胞培养。

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2项中国CDE药用辅料资质，

备案号：F20200000496、F20210000003；

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