【Part 1前言】

研究背景：

各种类型的干细胞由于其自我更新和多能分化的能力而成为组织工程中最有吸引力的细胞来源，主要可以通过生物材料支架调节干细胞的活性，进行病变和受损组织的再生或修复。

干细胞在支架内生长时，会将支架视为它们的微环境，并通过改变它们的行为做出相应的反应。组织工程多采用传统的大小固定支架和可注射生物材料，由于难以产生宏观功能组织而受到极大局限。

因此，精确控制支架特性和增加对细胞-材料间相互作用的方法，对于建立基于干细胞临床应用的组织工程技术至关重要。

面临挑战：

水凝胶因良好的可调性、可精确控制支架特性等对细胞生命活动有重要影响的特点，经常应用于组织工程，是研究细胞-物质相互作用或作为细胞载体促进组织修复时一个很有前途的工具。但在组织工程技术的体内应用中仍面临诸多挑战：

1.传统水凝胶：

在长期培养中往往会增加细胞衰老，或改变干细胞的“干性”，或影响分泌旁分泌因子的能力。

2. 自交联水凝胶：

• 诱导自交联的方法是基于特定的水凝胶体系，不能广泛应用于其他水凝胶制品；

• 在凝胶化过程中，对被包裹的细胞造成损伤；并且由于限制了细胞外基质和细胞间相互作用，从而影响凝胶化后的细胞活性；

• 其中，物理交联会导致水凝胶容易被机械符合破坏；化学交联可能与被包裹细胞的一定程度的毒性有关。

新的思路

3D微载体：

• 具有良好的生物相容性；

• 较大的比表面积更易于药物分子相互作用；

• 具有连接外部和内部的孔隙，可以促进营养物质和氧气和废物的有效运输；

• 为细胞提供多孔的微环境，保护细胞免受机械损伤，更好的维持细胞的活性和功能。

通过将间充质干细胞装载至3D微载体中形成微组织，并将其放置在3D打印的框架中，培养数天以诱导预组装成具有一定功能的组织结构。

【Part 2材料与方法】

利用3D打印技术制作网格框架，通过明胶微载体制备、细胞培养、制备装载MSC的微载体，将其装载至网状框架中。

对细胞的活性、凋亡、细胞功能性评估（三系分化、衰老）分泌组学分析、蛋白质组学分析、生物信息学分析以及预组装结构的宏观和微观力学测试。

最终通过进行三组对兔关节软骨缺损的体内植入动物实验和体外分析。

图1. 总体研究设计示意图

【Part 3结论】

3.1与非预组装微载体和2D细胞相比，预组装构建的间充质干细胞的特征和功能评价

预组装结构中生长的MSCs可以维持其干细胞表型，与非预组装微载体和2D的MSCs相似，并且能更好维持干细胞干性和抑制细胞衰老，通过进行对饥饿培养后细胞上清液进行分泌蛋白组分析，发现预组装结构培养的MSCs的旁分泌功能（如募集因子、增殖因子、免疫调节因子和血管生长因子）被激活。

图2. 预组装构建体中MSC与非预组装微载体和单层培养相比的表征和功能评估

3.2不同时间点组装的3D构建物的MSC特征和功能分析

D3可以观察到预组装结构的形成，D7可呈现预定义的形状，在D7和D14，移去框架，构建体的结构不变。培养7天内细胞活性相对稳定，在培养至14天，细胞增殖被大大抑制，细胞死亡也显著增加。随着培养时间的增加， ECM逐渐增加，并且在D7时因ECM的积累使3D微组织构建体的显著成熟，提供了满意的力学性能。

在构建后第7天,MSC的相关标志物（SOX2、NANOG和OCT4）显著上调并在D14保持相对稳定，衰老相关标志物（P16、P21和P53）在预组装过程开始后的D3就显著下调。预组装结构中培养的MSC在D7保持了最佳的干性并抑制了衰老过程，旁分泌功能随着时间的推移而增加。

图3. 在不同时间点预组装的3D构建体MSCs表征

3.3装载MSC的3D微载体预组装成功能结构的机制

在0、3、7、和14天，通过蛋白质组学特征分析预组装构建体的蛋白质，其中有199个高表达蛋白，并且在D14，高表达蛋白数量出现了显著翻倍变化，如COL4A2和SOD2。高表达的蛋白主要是ECM相关蛋白，如胶原蛋白、纤维连接蛋白和LOXL2，可以为基质成分或细胞表面受体提供结合位点，有助于促进细胞-基质相互作用形成复杂的3D网络。

图4. 微组织预组装成功能构建体的机制

3.4利用预组装构建体进行体内软骨修复

通过软骨缺损修复的宏观评价、组织学评价、免疫组学分析，发现使用3D构建体修复的软骨缺陷表面平整，几乎完全被再生组织填充，新生组织与周围正常软骨外观相似。填充的透明样软骨填充，与周围正常软骨的组织学特征相似。其他两组仅部分修复组织，表面不规则，修复组织质地柔软且存在明显的缺陷边界，以纤维状和软骨样软骨的混合物进行修复。3D构建组的软骨修复效果比其他两组好。

图5. 使用预组装构建体进行体内软骨修复

【Part 4总结】

通过将含有间充质干细胞的3D微载体来预组装成的3D功能组织结构，不但在维持MSCs的表型特性和干性上优势突出，更在抑制其衰老和增强其旁分泌功能方面也表现出显著能力。同时，预组装的机制被证明与ECM积累有关，可加强结构内细胞-ECM的相互作用。

在兔关节软骨缺损模型中，预组装的3D构建体通过形成透明状软骨显现出诱导缺损能力较强，在单独微载体细胞填充和对照组中均未发现，因此预组装的构建体可以作为替代组织工程植入物来促进组织缺陷的体内修复。

这种开发3D宏观组织结构的策略允许优化干细胞功能和构建仿生组织类器官，具有广泛应用于各种组织和组织工程的潜力。

【Part 5研究相关产品】

3D TableTrix® 微载体

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